Points of Significance: multiple-testing correction

简介

Nature methods从2013年9月开始发表月刊Points of Significance系列，该系列主要介绍统计在生物学中的应用，让读者可以更正确的理解及使用统计。有研究发现，在医学类期刊上发表的文章中，有接近半数的统计方法的使用都是不正确的，所以Nature methods推出该系列统计文章，以实用易懂的方式来介绍统计中的一些基本概念。

知识点

1.Bonferroni多重检验校正方法

2.Holm多重检验校正方法

3.BH多重检验校正方法

4.Storey多重检验校正方法

5.P值的分布为什么是均匀分布？

主要内容

        大家还记得为什么p值小于0.05的时候就被认为显著吗？对的，因为我们将可以容忍的第一类错误alpha设定在了0.05，所以当我们的p值小于0.05时，我们就认为是显著的。假如我们给小鼠吃药，我们想看吃完药之后小鼠的基因表达是否有显著变化。那么我们是可以用t检验来做的，如果设定alpha的值为0.05，那么很显然，假如我们所有的N个基因都没有显著变化，那么根据p值的定义，我们也会有0.05N个基因被认为是有显著变化的。例如，如果有10000个基因被检验，那么将会有500个基因被错误的认为有变化。

下面我们来看个例子

        如上图a所示，左边一列是小鼠吃药前各个基因的表达，右边一列是吃药后小鼠各个基因的表达，吃药后的表达有一定比例的基因会有显著变化。

        如上图b左边的图所示，假如图a右边一列基因表达有10%的基因收到影响，在总共有10000个基因的情况下，且检验效应为80%，alpha为0.05时，将会有1250个基因会被检验出来p值小于0.05。

        简单说一下为什么是1250个基因，假设了10%的基因收到影响，也就是说真实情况1000个基因有显著变化，另外9000个没有显著变化。在检验效应为80%时，1000个显著变化的基因中有80%也就是800个基因被认为有显著变化。又由于alpha为0.05，也就是说，9000个没有变化的基因中会有5%也就是450个基因被错误的认为有显著变化。800加上450是1250，所以共有1250个基因被认为有显著变化。在这种条件下，检测出来的1250个基因中有大约三分之一都是错的。

同样的，

        如图b右边的图所示，当条件和左边的图都相同，但是有显著变化的基因有50%，此时该计算将会检测会4250个基因会被认为有显著变化，4000个是正确的，250个是错误的，错误率此时只有十七分之一。

        其实，当受到实验条件影响，有显著变化的基因比例越小，检测出来的错误率就越高。比如若10000个基因中只有1%是真实有显著变化的。此时的错误率将达到大约七分之六，计算方式和刚才相同，感兴趣的同学可以自行计算一下。

多重检验校正常用方法

        上面说了这么多，无非就是想说，如果我们统计检验的次数多了，会有很高的错误率，特别是当受影响的基因比例很小的时候。那么该怎么办呢？没错，这就是今天我们的主题，多重检验校正。下面我们介绍几种比较基本和常用的多重检验校正的方法。

1.Bonferroni多重检验校正

        Bonferroni多重检验校正的主要思想是，保证检验出来的有显著变化的数量小于1。具体操作是，对于多重检验求出来的所有p值，都乘以检验次数。刚才的例子中，若10000个基因被检验，某个基因检验出来p值为0.00001，用Bonferroni多重检验校正将其乘以10000变为0.1，然后再跟0.05比，若比0.05小则显著，比0.05大则不显著。

        Bonferroni多重检验校正太强了，若是我们采用10个基因来进行比对，本来单个基因的检验效应为80%，Bonferroni检验校正后，检验效应只有大约33%。若是采用100个基因进行多重检验校正，那么效应效应降低为大约只有8%，若使用10000个基因的话，那检验效应就只有0.2%。这是什么概念，就是说，如果10000个基因有10%也就是1000个基因有显著变化的话，在0.2%的检验效应的条件下，只有2个基因会被认为是显著的。1000个真实有变化的基因只有2个基因能够被检验出来的检验方法可用吗？

2.Holm多重检验校正

        为了降低Bonferroni检验校正的强度，可以使用Holm多重检验校正。Holm多重检验校正操作方式如下：假如检验次数为N，首先对所有检验结果的p值进行排序，从小到大排序。然后对第一个值p值乘以N进行校正，对第二个p值乘以N-1进行校正，对第三个p值乘以N-2进行校正，以此类推。若再校正后p值大于1则将p值设定为1。

        Holm多重检验校正显然是Bonferroni检验校正的一种弱化。

3.BH多重检验校正

        BH多重检验校正的强度比Holm的强度还弱，具体操作如下。假如检验次数为N，首先对所有检验结果的p值进行排序，从小到大排序。然后对第一个值p值不变，对第二个p值乘以N再除以N-1进行校正，对第三个p值乘以N再除以N-2进行校正，以此类推。若再校正后p值大于1则将p值设定为1。

        从计算方式中我们也能看出来该检验校正比Holm弱。

4.Storey多重检验校正

        在说Storey多重检验校正之前，我们首先要理解p值的分布。假如我们所有基因都是从吃药前的小鼠来的，那么根据p值的定义，若是某次抽样抽到x，那么p值大小为该分布下x右边的面积。然后我们想想概率分布的密度函数是什么？假如有了一个密度分布，当从中取值小于等于x时的概率为多少？我们概率论中学密度函数的时候学过，就是该分布x左边的面积。那么我们来看，p值的分布该是怎么样，当p等于0.05时，在p值的密度分布中，0.05左边对应着p值小于0.05，p值小于0.05的概率在抽样分布中就是0.05。所以综上可以知道，在p值的密度分布中，0.05左边的面积是0.05,0.1左边的面积是0.1等等。这也就是说p值的分布是一个均匀分布。（不知道有没有讲清楚）。

        好了，既然在都没有显著变化的时候p值的分布应该是一个均匀分布。那么显然，若是存在显著变化的基因，p值小于0.05的数量会增加，那么p值的分布就会变化成p值小的部分很高，如下图所示。

        上图a中上下两排分别是受影响的基因占10%和50%时p值的分布。如上图b所示，若是我们直接去小于0.05的为显著，我们错误率会很高，红色部分都是错误的。

        Storey多重检验校正是估计没有变化的样本数量来进行校正的。如上图c所示，在右边分布竖直取一个值lambda=05， 然后计算0.5右边p值的数量M。然后就认为2M为没有收到影响的基因的数量。那么就认为只有前N-2M个p值是显著的。

多重检验校正性能比较

        上面介绍了四种常用的多重检验校正方法，那么他们的效应怎么呢。

        如上图所示，分别展示的是10%的基因有显著变化（左边）和50%的基因有显著变化（右边）在总基因数N在不同取值时的情况。两个图中分别展示了不做校正，Bonferroni校正，BH校正和Storey校正情况下的检验效应（蓝色），FPR假阳率（粉色）和FDR错误率（棕色）。

        总体来说，可以发现，检验校正强度Bonferroni最小，BH次之，Storey最小。

系列索引

1. Points of Significance: Importance of being uncertain

2. Points of Significance: Error bars

3. Points of Significance: Significance, P values and t-tests

4. Points of Significance: Power and sample size

5. Points of Significance: Visualizing samples with box plots

6. Points of Significance: Comparing samples part I

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参考文献

1. Krzywinski, M., and Altman, N. (2014). Points of significance: Comparing samples—part II. Nature methods 11, 355-356.

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